La fluorescencia se produce cuando una molécula absorbe luz de una determinada longitud de onda (energía), y emite luz de una longitud de onda superior (menor energía).
Cuando una molécula es excitada por un haz de luz de una intensidad y energía determinadas, absorbe energía y se produce el paso de sus electrones de un estado basal a un estado excitado, liberando esta energía en forma de luz, resultando en una emisión fluorescente o fluorescencia.
Técnica espectrofotométrica que se basa en la absorción de radiación por parte del analito a medir en una muestra y su posterior emisión.
Muestras biológicas de iones, enzimas, coenzimas, vitaminas, algunos medicamentos, etc.
Su gran aplicación es el fluoroinmunoanálisis que utiliza Ac marcados con una sustancia fluorescente, específicos de la sustancia a estudiar.
Fosforescencia
La fosforescencia es un fenómeno en el cual ciertas sustancias tienen la propiedad de absorber energía y almacenarla, para después emitirla gradualmente en forma de luz .
El principio físico en el que se basa la fosforescencia es el mismo que el de la fluorescencia, la principal diferencia radica en la forma de emitir la luz absorbida.
En la fluorescencia es casi simultánea, y en la fosforescencia es retardada.
Quimioluminiscencia
Fenómeno que en algunas reacciones químicas, la energía liberada no sólo se emite en forma de calor o de energía química sino en forma de luz.
Normalmente, en estas reacciones de quimioluminiscencia se liberan moléculas con estado excitado que al bajar a su estado emiten la diferencia de energía en forma de luz.
A medida que progresa la reacción, los cambios de la composición química y la luz, disminuyen hasta desvanecerse por completo como resultado de la conversión.
Generalmente la quimioluminiscencia es muy breve.
Espectrofotometría de absorción atómica
Es una técnica para determinar la concentración de un elemento metálico determinado en una muestra.
Refractometría
Es una técnica analítica que consiste en la medida del índice de refracción de un líquido con objeto de investigar su composición si se trata de una disolución o de su pureza si es un compuesto único.
La medida continua en una columna cromatográfica puede indicar la composición o pureza del eluyente.
En el laboratorio de análisis clínicos se emplea el refractómetro para la medición de la concentración de solutos tales como la albúmina en muestras séricas y/o plasmáticas, y la medida del peso específico en orina.
Reactivos para química seca
Los reactivos de química seca constituyen la manera de introducir la muestra en los fotómetros de reflexión.
Son unidades de reacción con una fase sólida: poseen en forma deshidratada, todos los componentes que se necesitan para la identificación de un analito determinado.
Modo de empleo: la muestra que contiene el analito a determinar (suero, plasma, sangre total, orina) se aplica sobre la superficie del reactivo en fase sólida, y a partir de esta difunde a la matriz, disolviendo los componentes de reacción que contiene; cuando los reactivos se disuelven se produce la reacción, que se cuantificara por fotometría de reflectancia.
Todos los sistemas constan de tres partes:
Parte soporte
Está constituida por una lámina de plástico, sobre la cual se construye el reactivo de fase sólida.
Parte reflectante
Su función es reflejar la luz; está hecha de materiales reflectantes como metales, o materiales fibrosos como el papel.
Parte reactiva
Contiene, en forma deshidratada todos los reactivos y sustancias auxiliares necesarias para que se produzca una reacción.
Los reactivos son reconstituidos mediante rehidratación por el agua de la muestra
A veces se añaden otras capas con funciones complementarias como una capa difusora (con lo cual la muestra difunde rápidamente hacia los laterales y se distribuye uniformemente) o una capa separadora de plasma (la utilizan los sistemas preparados para trabajar con sangre total, su función es retener las células y permitir el paso del plasma hacia la matriz del reactivo).
La estructura de las capas depende del sistema reactivo de fase solida que se trate, variando de unos a Otros.
Tiras reactivas
Se utilizan para:
-análisis de orina
-autocontrol de la glucemia
-en sistemas de diagnóstico rápido en la consulta médica y a la cabecera del enfermo.
Consisten, básicamente en un soporte de plástico que sirve de soporte a una matriz de celulosa que contiene los reactivos secos necesarios para que se produzca una reacción con el componente a estudiar.
Tira reactiva del sistema Seralyzer (Ames): consiste en una matriz de celulosa impregnada de reactivos secos que se unen a una lamina soporte de plástico; sobre ella lleva una franja código, que tiene como finalidad ser leída cuando se la inserta en el instrumento.
Tira reactiva del sistema Reflotron (Boheringer Mannheim): consta de una lámina soporte al cual se le adhiere el sistema reactivo separado en dos zonas:
-una está unida a la lamina. Incluye una serie de capas destinadas a la preparación de la muestra.
-la otra se encuentra inicialmente separada de la lámina soporte, y se pone en contacto con ella por simple presión cuando se desea que el plasma entre en contacto con los reactivos para desencadenar la reacción; esta zona lleva en su superficie una laminilla transparente a través de la cual se realizara la lectura.
La disposición en dos bloques hace posible que la parte destinada a la preparación de la muestra se puedan llevar a cabo etapas de preincubación o eliminación de interferentes.
Esta tira incorpora también una capa separadora de fibra de vidrio para la obtención de plasma, con lo cual evitamos la centrifugación previa al análisis.
Ventajas de las tiras: al mantener los reactivos deshidratados aportan una prolongada estabilidad al sistema, que puede ser de meses e incluso de uno o dos años.
Películas multicapa o slides
Están constituidas por diferentes capas muy finas, a través de las cuales se van produciendo todas las etapas necesarias para la determinación cuantitativa del analito. Tiene la apariencia de una diapositiva y está constituido por cuatro capas (que incluyen todos los componentes del sistema). El sistema de más amplia implantación es el Ektachem (Kodak).
Capa difusora: sobre ella se deposita la muestra. Lleva sustancias capaces de reflejar la luz, es la superficie reflectante. Homogeneíza la muestra antes de que llegue a la capa reactiva, distribuyéndola por toda la superficie. Retiene células, cristales y pequeñas y grandes moléculas, así la muestra se convierte en un filtrado libre de proteínas, eliminándose las interferencias.
Capa reactiva: pueden ser una o varias, son las que contienen los reactivos.
Capa soporte: está hecha de plástico transparente y sobre ella se depositan todas las demás capas una tras otra. Tiene doble función: servir de soporte y dejar pasar la luz, ya que la lectura se hace por la parte inferior (la opuesta a la de la aplicación de la muestra).
