Agar de Hierro de Kligler

Diferenciación de enterobacterias. 

El agar de hierro de Kligler es un medio para diferenciar bacilos entéricos gram negativos en una forma similar al agar Hierro y Triple Azúcar (TSI) y se basa en las mismas propiedades de fermentar glucosa y lactosa junto con la formación de sulfuros. 

Usos

Inocular el medio con la colonia en estudio por picadura en el fondo y estría en la superficie. 

Los gérmenes fermentadores de la lactosa acidifican totalmente el medio, comunicándole a este un color amarillo. 

Los microorganismos que no fermentan la lactosa acidifican solamente el fondo del medio, permaneciendo la superficie del mismo color original rojo cereza. 

Y por ultimo los formadores de sulfuro de hidrogeno, ennegrecen el medio.

Los resultados se interpretan de igual manera que el Agar de Hierro y Triple Azúcar. 

Se recomienda usar el medio el mismo día de su preparación. 

Organismos	Superficie inclinada	Fondo	Gas	H2S
Enterobacter	Acida	Alcalina	+ +	−
Hafnia	Alcalina	Acida	+	−
Klebsiella	Acida	Acida	+ +	−
Escherichia coli	Acida (Alcalina)	Acida	+(−)	−
Shigella	Alcalina	Acida	−	−
Salmonella typhi	Alcalina	Acida	−	+
Salmonella paratyphi	Alcalina	Acida	+	−
Salmonella cholerasuis	Alcalina	Acida	+	−
Otras salmonellas	Alcalina	Acida	+	+ + +
Citrobacter	Alcalina (Acida)	Acida	+	+ + + (−)
Edwarsiella	Alcalina	Acida	+	+ + +
Serratia	Alcalina (Acida)	Acida	−	−
Proteus	Alcalina	Acida	+	−
Proteus vulgaris	Acida (Alcalina)	Acida	+	+ + +
Proteus mirabilis	Alcalina (Acida)	Acida	+	+ + +
Proteus morganii	Alcalina	Acida	−	−
Proteus rettgeri	Alcalina	Acida	−	−
Providencia	Alcalina	Acida	+o (−)	−

( ) = Reacciones ocasionales

Se utiliza este medio en la diferenciación de enterobacterias.

En el mismo medio se pueden determinar:

1. Fermentación y utilización de los hidratos de carbono.
2. Producción de sulfhídrico
3. Producción de gas.

(Kligler) contiene glucosa y lactosa.

TSI contiene glucosa, lactosa y sacarosa.

Se preparan en tubos poco inclinados y con bastante medio, inoculándolos por picadura en el centro del medio y realizando además una estría recta al salir sobre la superficie inclinada del medio.

La producción de ácido de glucosa se pone de manifiesto en el fondo del tubo por viraje del indicador a amarillo, la de la lactosa en la superficie inclinada por viraje al amarillo, la producción de gas a partir de glucosa por aparición de burbujas que agrietan el medio y la de sulfhídrico por la aparición de un precipitado negro debido a las sales de hierro presentes.

Introducción
El agar triple azúcar hierro es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio.
También permite la detección de la producción de H2S.

Es un medio útil para la identificación de enterobacterias.

Principio

El agar se prepara en forma de pico de flauta.

Esto determina que existan dos cámaras de reacción dentro del mismo tubo.
La porción inclinada (pico) expuesta en toda su superficie al oxígeno es aerobia y la porción inferior (fondo) está protegida del aire y es relativamente anaerobia.

Al crecer un microorganismo en el TSI, el pico tiende a virar al pH alcalino (color rojo por el rojo fenol) por la producción de aminas, debido a la utilización aerobia de las peptonas.

En el fondo del tubo -donde no hay oxígeno- la degradación de peptonas es menor y no se generan aminas, de manera que se pueden detectar la producción de pequeñas cantidades de ácido (color amarillo por el rojo fenol).

Si se inoculan microorganismos no fermentadores no se formarán ácidos, pero por la producción de aminas en el pico, todo el medio quedará rojo.

La glucosa en el TSI está en una proporción 10 veces menor que la lactosa y la sacarosa.

Si el TSI es inoculado con una bacteria fermentadora de glucosa pero no de lactosa ni de sacarosa, la cantidad de ácido producida por fermentación será baja (porque la cantidad de glucosa inicial es baja).

En las primeras horas (10 a 16 hs) de incubación se producirá viraje del indicador al amarillo en todo el tubo (pico y fondo), pero al continuar la incubación, el pico del tubo retornará al rojo por la producción de aminas debida a la degradación aerobia de las peptonas antes descrita.

Si el microorganismo fermenta la lactosa y/o la sacarosa, como las concentraciones de estos azúcares son 10 veces mayores a la glucosa, se producirá gran cantidad de ácido (que no puede ser neutralizado por la producción de aminas en la superficie), por lo tanto todo el tubo (pico y fondo) virará al color amarillo (ácido).

La producción de H2S a partir de tiosulfato se pone en evidencia por precipitación del sulfuro ferroso (negro).

Como esta reacción se da preferencialmente en medio ácido, un ennegrecimiento del fondo del tubo (que puede cubrir todo el fondo del tubo y enmascarar el color amarillo) se lee como fermentación de algunos de los azúcares del medio.

Además puede observarse la producción de gas (H2 y CO2), ya sea como burbujas en el fondo del tubo, por ruptura del agar o desplazamiento del mismo hacia la superficie. 

Composición:
 

·         Extracto de carne    3 g

·         Extracto de levadura          3 g

·         Peptona                    15 g

·         Proteosa peptona   5 g

·         Lactosa                                 10 g

·         Sacarosa                  10 g

·         Glucosa                    1 g

·         Cloruro de sodio     5 g

·         Sulfato ferroso                    0,2 g

·         Tiosulfato de sodio 0,3 g

·         Agar                           12 g

·         Rojo fenol                 0,024 g

·         Agua destilada                    1 L

pH = 7,4 ± 0,2

 

Procedimiento

1. Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto).
2. Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm del fondo del tubo.
3. Tras retirar la punta del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado.
4. Incubar a 35 °C durante 18-24 hs, pero no más de 24 hs.

Interpretación y Controles

Para el TSI siempre se informa el resultado en el siguiente orden:

Pico, fondo, producción de gas y H2S.
Pico alcalino/fondo alcalino (Alc/Alc/gas-/H2S)
No hay fermentación de azúcares.

Característica de bacterias no fermentadoras como Ej.

Pseudomonas sp

Pico alcalino/fondo ácido (Alc/A/gas-/ H2S-)
Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas.
No hay producción de gas ni de H2S.

Shigella spp.

Pico alcalino/fondo ácido (Alc/A/gas-/ H2S+)
Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas.
No hay producción de gas, si de H2S.

Salmonella typhi.

Pico alcalino/fondo negro (Alc/A/gas+/H2S+)
Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, producción de gas y producción de ácido sulfhídrico.

Salmonella spp. (La mayoría de las especies de Salmonella).

Pico ácido/fondo ácido (A/A)
Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas.
Puede producirse H2S o no. (A/A/H2S – o +)

Escherichia coli

Pico ácido/fondo ácido (A/A)
Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas.

A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas.

Ej. A/A/gas+/H2S-.

Indicador: Rojo de fenol

§ Ácido: amarillo
§ Alcalino: rojo
§ Medio no inoculado: naranja rojizo (pH =7.4)